Spektrofotometar je jedan od znanstvenih instrumenata koji se često nalaze u mnogim istraživačkim i industrijskim laboratorijima. Spektrofotometri se koriste za istraživanje u laboratorijima fizike, molekularne biologije, kemije i biokemije. Obično se naziv odnosi na ultraljubičasto vidljivu (UV-vis) spektroskopiju.
Energija svjetlosti ovisi o njezinoj valnoj duljini, obično se naziva lambda. Iako se elektromagnetski spektar proteže u ogromnom rasponu valnih duljina, većina laboratorija može mjeriti samo mali dio njih. UV-Vis spektroskopija mjeri između 200 i 400 nanometara (nm) za mjerenje UV svjetla i do oko 750 nm u vidljivom spektru.
Za UV-Vis spektroskopiju, uzorci se obično sadrže i mjere u malim posudama zvanim kivetama. Ako se koriste u vidljivom spektru, oni mogu biti plastični, ali ako ih se koristi za UV mjerenje, moraju biti kvarcni ili fuzijski silicij. Postoje strojevi koji mogu koristiti staklene epruvete.
Vidljiva spektroskopija se često industrijski koristi za kolorimetriju. Pomoću ove metode uzorci se mjere na više valnih duljina od 400-700 nm, a njihovi se profili apsorpcije uspoređuju sa standardom. Ovu tehniku često koriste proizvođači tekstila i tinte. Ostali komercijalni korisnici UV-Vis spektroskopije uključuju forenzičke laboratorije i pisače.
U biološkim i kemijskim istraživanjima otopine se često kvantificiraju mjerenjem njihovog stupnja apsorpcije svjetlosti na određenoj valnoj duljini. Vrijednost koja se zove koeficijent izumiranja koristi se za izračunavanje koncentracije spoja. Na primjer, laboratoriji za molekularnu biologiju koriste spektrofotometre za mjerenje koncentracija uzoraka DNA ili RNA. Ponekad imaju napredni stroj zvan NanoDrop ™ spektrofotometar koji koristi djelić količine uzorka u usporedbi s onom koju koriste tradicionalni spektrofotometri.
Da bi kvantifikacija bila valjana, uzorak se mora pridržavati Beer-Lambertovog zakona. Ovo zahtijeva da apsorbancija bude izravno proporcionalna duljini putanje kivete i apsorpciji spoja. Postoje tablice koeficijenata izumiranja za mnoge spojeve, ali ne za sve.
Mnoge kemijske i enzimske reakcije s vremenom mijenjaju boju, a spektrofotometri su vrlo korisni za mjerenje tih promjena. Na primjer, enzimi polifenol oksidaze koji uzrokuju da voće smeđe oksidira otopine fenolnih spojeva, mijenjajući bistre otopine u one koje su vidljivo obojene. Takve se reakcije mogu ispitati mjerenjem povećanja apsorpcije kako se boja mijenja. U idealnom slučaju, brzina promjene će biti linearna i iz tih podataka možete izračunati stope. Napredniji spektrofotometar će imati držač kivete s kontroliranom temperaturom za provođenje reakcija na točno određenoj temperaturi idealnoj za enzim.
Mikrobiološki i molekularni biološki laboratoriji često koriste spektrofotometar za mjerenje rasta kultura bakterija. Pokusi kloniranja DNK često se rade na bakterijama, a istraživači trebaju izmjeriti fazu rasta kulture da bi znali kada provesti određene postupke. Na spektrofotometru mjere apsorbanciju koja je poznata kao optička gustoća (OD). Iz OD-a se može utvrditi da li se bakterije aktivno dijele ili počinju umrijeti.
Spektrofotometri koriste izvor svjetla za osvjetljavanje niz valnih duljina kroz monokromator. Ovaj uređaj tada prenosi usku traku svjetlosti, a spektrofotometar uspoređuje intenzitet svjetlosti koji prolazi kroz uzorak s onim koji prolazi kroz referentni spoj. Na primjer, ako je spoj otopljen u etanolu, referenca bi bila etanol. Rezultat je prikazan kao stupanj apsorpcije razlike među njima. To ukazuje na apsorpciju uzorka spoja.
Razlog ove apsorpcije je u tome što i ultraljubičasto i vidljivo svjetlo imaju dovoljno energije da kemikalije pobude do veće razine energije. Ovo pobuđenje rezultira većom valnom duljinom, što je vidljivo kada je apsorbancija prikazana prema valnoj duljini. Različite molekule ili anorganski spojevi apsorbiraju energiju na različitim valnim duljinama. Oni s maksimalnom apsorpcijom u vidljivom rasponu vide se u boji ljudskog oka.
Otopine spojeva mogu biti bistre, ali apsorbirati u UV rasponu. Takvi spojevi obično imaju dvostruke veze ili aromatske prstenove. Ponekad postoje jedan ili više vrhova koji se mogu otkriti kada se stupanj apsorpcije crta prema valnoj duljini. Ako je to slučaj, ovo može pomoći u identifikaciji nekih spojeva usporedbom oblika crteža s onim poznatih referentnih parcela.
Postoje dvije vrste UV-Vis spektrofotometrskih strojeva, jednosmjerni i dvostruki. Te se razlike razlikuju u načinu mjerenja intenziteta svjetlosti između referentnog i ispitnog uzorka. Strojevi s dvostrukim snopovima istodobno mjere referentni i ispitni spoj, dok strojevi s jednim snopom mjere prije i nakon dodavanja ispitnog spoja.